透射電鏡觀察:可見凋亡細胞表面微絨毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊.集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和調(diào)亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現(xiàn)象。

結(jié)果評判:調(diào)亡細胞體積變小，細胞質(zhì)濃縮。調(diào)亡I期( pro-apoptosis nuclei)的細胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象( cavitati)的空泡結(jié)構(gòu); IIa 期細胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化;細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生調(diào)亡小體。3%的上層瓊脂，每孔加1ml上層瓊脂和100ul單細胞懸液(約1000ell/wel)，混勻，室溫凝固。

細胞傳代培養(yǎng)

操作步驟

1.將長滿細胞的培養(yǎng)瓶中原來的培養(yǎng)液棄去。

2、加入0.5- -1ml 0.25%胰酶溶液，使瓶底細胞都浸入溶液中。

3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置鏡下觀察細胞。隨著時間的推移，原貼壁的細胞逐漸趨于圓形，在還未漂起時將胰酶棄去，加入10m培養(yǎng)液終止消化。觀察消化也可以用肉眼，當見到瓶底發(fā)白并出現(xiàn)細zhen孔空隙時終止消化。一般室溫消化時間約為1- -3分鐘。細胞沉淀用15mlMEF生長培養(yǎng)基重懸后進行細胞計數(shù)(--般8只14天的胎鼠可獲得2-3x107細胞)。

4、用吸管將貼壁的細胞吹打成懸液，分到另外兩到三瓶中，實踐培養(yǎng)液塞好橡皮塞，置37°C下繼續(xù)培養(yǎng)。第二天觀察貼壁生長情況。

附:消化液配制方法:

稱取0.25克胰酶蛋白酶(活力為1 : 250)， 加入100ml無Ca2+、Mg2+的Hank's液溶解，濾器過濾chu菌，4°C保存,用前可在379C下回溫。胰酶溶液中也可加入EDTA，使zui終濃度達0.02%。

雜交瘤細胞基因測序

雜交瘤細胞有丟失高特異性高活性的風(fēng)險，或者細胞狀態(tài)不好乃至。而經(jīng)過雜交瘤測序，可以獲得相應(yīng)的序列，可以以重組蛋白的方式來穩(wěn)定獲得；貼壁細胞:先倒出培養(yǎng)液，采用胰蛋白酶消化或者用細胞刮(會產(chǎn)生碎屑)刮下:帶培養(yǎng)液進行離心，100-1500/mim510min。從而使得研發(fā)或生產(chǎn)者不必以雜交瘤細胞為載體保留該，而可以以堿基序列的形式進行保存和傳播交流、鑒定。同時還可以使用獲得的測序結(jié)果進行等知識產(chǎn)權(quán)方面的申請審批。有時為了進一步大規(guī)模生產(chǎn)或進行人源化等生物工程操作/修飾，有必要了解雜交瘤所表達的對應(yīng)的基因序列以進一步進行生物工程操作與生產(chǎn)。

相較于直接對進行基于蛋白質(zhì)分析的測序相比，得益于基因測序技術(shù)的發(fā)展，雜交瘤測序可以提供的結(jié)果，防止蛋白測序中如亮氨酸/異亮氨酸較難區(qū)分等潛在風(fēng)險。

Q:如何避免中沉淀物的出現(xiàn)？

A:首先要注意正確的解凍步驟，而且溶解過程中一定要每隔一段時間均勻而緩慢的搖動。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在下列情況下沉淀物可能增加，使用中應(yīng)該盡量避免：

（1）熱滅活；

（2）在 37℃ 下培養(yǎng)；

（3）反復(fù)凍融；

（4）γ 射線照射；

（5）長期儲存在 2-8℃；

（6）在室溫下放置時間過長

Q:如何去除中的沉淀？

A:如想去除這些絮狀沉淀物，可以將分裝到無菌離心管中，以 400g 離心，上清液即可直接加入到培養(yǎng)基 內(nèi)一起過濾。

注意：不要以過濾的方式去除這些絮狀沉淀物，因為這可能阻塞濾膜。