MTT檢測

MTT 是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。(-般而言，陰性分離法的磁珠用量比陽性分離法的大，陽性分離法用行更多。其檢測原理為活xi胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性 MTT 還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二jia基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免yi檢測儀在 570nm 波長處測定其光吸收值，可間接反映活xi胞數(shù)量。

大鼠gu髓間充質(zhì)gan細(xì)胞的分離

操作方法

(1 )取SD大鼠( 2周齡)，頸椎脫臼法處死后立即用75%乙醇浸泡，移入超凈工作臺(tái)內(nèi)，用大頭針固定大鼠四肢于工作臺(tái)面的泡沫板上。

(2)碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，無菌條件下用滅菌消毒后的鑷子和剪刀分離出大鼠股骨和脛骨，剔除骨頭表面肌肉, PBS溶液沖洗兩遍。

(3 )從中間剪斷股骨和脛骨，用2ml無菌注she器吸取DMEM/F 12溶液沖出gu髓細(xì)胞多次，再用針頭吹打，吸管吸入離心管內(nèi)，1000r/min離心5min，棄上清，用PBS重懸細(xì)胞。

(4 )緩慢將細(xì)胞懸液加入預(yù)先裝有5mL淋巴細(xì)胞分離液的15mL離心管內(nèi)，保持細(xì)胞懸液在淋巴細(xì)胞分離液上層，注意不要攪動(dòng)液面,保持二者分層界面。

(5 ) 2000rpm離心15-25min，離心后溶液分4層，吸取中間骨sui基質(zhì)細(xì)胞層(白色渾濁狀)， PBS洗三次。

(6)用含15%胎牛xue清及青鏈mei素的DMEM/F 12以106/mL的細(xì)胞濃度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中， 置37°C、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

( 7 ) 24小時(shí)后棄去培養(yǎng)液(看細(xì)胞貼壁情況)，PBS沖洗2-3次去除末貼壁細(xì)胞，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。以后每3d半量換液1次，-般10d細(xì)胞生長融合。

(8 )經(jīng)0.25%胰酶消化，1 : 2傳代，其后一般3-5d傳代1次,選取生長良好的第三代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

BrdU染色原理

BrdU (5-脫氧尿核苷)是胸腺的衍生物，常用于標(biāo)記中新合成的DNA,可代替胸腺選擇性整合到細(xì)胞中新合成的DNA中(細(xì)胞周期S期)。通常改變抑制ES細(xì)胞不分化狀態(tài)的培養(yǎng)條件,ES細(xì)胞就可以分化成多種細(xì)胞類型。這種摻入可以穩(wěn)定存在，隨著DNA進(jìn)入子細(xì)胞中BrdU特異性可以用于檢測BrdU的摻入，從而判斷細(xì)胞的增殖能力。BrdU特異性可以用于檢測BrdU的摻入，從而判斷細(xì)胞的增殖能力。

zhu射或細(xì)胞培養(yǎng)后利用抗Brdu單，ICC染色，顯示增殖細(xì)胞。6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養(yǎng)板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計(jì)數(shù)所顯示出的顏色的斑點(diǎn)。同時(shí)結(jié)合其它細(xì)胞標(biāo)記物，雙重染色，可判斷增殖細(xì)胞的種類，增殖速度，對(duì)研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)有重要意義。因組織細(xì)胞內(nèi)無內(nèi)源性Brdu存在，所以Brdu應(yīng)用較廣摻入雙鏈DNA內(nèi)的Brdu,以氫鏈與腺呤結(jié)合，不能直接與抗Brdu反應(yīng)，需經(jīng)解鏈?zhǔn)笲rdu暴露方能被染色。常用的解鏈方法為鹽酸加熱、蛋白酶處理等，使DNA雙鏈部分單鏈化，抗Brdu小鼠單與增殖細(xì)胞核內(nèi)的Brdu結(jié)合，再經(jīng)酶標(biāo)抗小鼠IgG孵育、